1. 述评和综述模板

中国功能性胃肠病规范化诊治的特殊性

方秀才

中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院消化内科，北京 100730 

作者简介：方秀才，北京协和医院消化内科主任医师，教授，研究方向：功能性胃肠病。

中华医学会消化病学分会功能性胃肠病协作组副组长，功能性胃肠病-罗马Ⅳ专家委员会委员，罗马基金会董事、国际联络员委员会委员，功能性胃肠病－罗马Ⅲ、罗马Ⅳ中文版主译，《胃肠病学和肝病学杂志》副主编。

 [摘要] “罗马Ⅳ”为功能性胃肠病提供了规范化治疗可遵循的国际标准，我国功能性胃肠病患者临床表现有一定的特殊性，需要鉴别诊断的疾病谱有所不同，文化和医疗资源的差异等需要我们充分认识我国FGIDs诊治的特殊性。

[关键词] 功能性胃肠病；诊断；治疗

中图分类号：R57              文献标识码：A             文章编号：         收稿日期：2019-03-20    

Particularity of standardized diagnosis and treatment for functional gastrointestinal disorders in China

FANG Xiucai

Department of Gastroenterology, Peking Union Medicine College Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100730, China

[Abstract] “RomanⅣ” provides the global criteria of optimizing the diagnosis and treatment for functional gastrointestinal diseases (FGIDs). It is important for our Chinese clinicians to understand our patients with FGIDs do presented some particularities in clinical manifestations, the disease spectrum which being involved in the differential diagnosis of FGIDs differ from Western countries. We also need to consider cultural and medical resources difference during our clinical practice for FGIDs.

[Key words]  Functional gastrointestinal diseases; Diagnosis; Treatment

“罗马Ⅳ：功能性胃肠病”颁布近3年，我国学者对罗马Ⅳ诊断标准有了全面的了解。罗马Ⅳ委员会在修订诊断标准时充分考虑到了区域和多元文化对功能性胃肠病（functional gastrointestinal disorders, FGIDs）及其诊治的影响，期望“罗马Ⅳ”能更好地帮助广大临床工作者诊断FGIDs，理解这些疾病可能的病理生理机制，在建立良好的医患关系的基础上为患者选择有效的治疗方案，同时也使临床研究和临床药物试验有统一的可遵循的标准^[1]。可见其初衷是更好地指导FGIDs的规范化诊治。修订诊断标准的循证学资料主要来源于西方人群，我国患者临床表现的特殊性、需要鉴别诊断的疾病谱不同、文化和医疗资源的差异等需要我们充分认识我国FGIDs诊治的特殊性。

1  中国患者FGIDs临床表现的特殊性

我国学者对罗马Ⅳ肠易激综合征（irritable bowel syndrome, IBS）诊断标准中删去的核心症状腹部不适的修改反响最为强烈。该修改主要是基于不同文化背景的患者对腹部不适的理解存在差异，从西方国家已有的资料推测在诊断标准中删去腹部不适并不影响绝大多数IBS患者的诊断。然而，在我国就诊的IBS患者中，22.6%～35.9%患者仅有腹部不适，没有腹痛。仅此修改使我国1/4～1/3就诊IBS患者不能再诊断为IBS，实际上仅有腹部不适的IBS患者和以腹痛为主的IBS患者在临床表现特点和心理学特点方面并无显著差异^[2,3]。此外，我国的研究资料显示，我国IBS常存在与排便相关的上腹痛^[4]，合并腹胀比例高（64.3%～70.0%），腹部不适与上腹饱胀、急迫感排便费力、排便不尽感无关，这些临床表现均有别于西方患者^[3]。

基金项目：国家国际科技合作专项项目（2014DFA31850）

2  幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，H. pylori）相关性消化不良诊断的特殊性

H.pylori在功能性消化不良（functional dyspepsia, FD）发病中的作用一直存在争议。早先对非溃疡样消化不良合并H.pylori感染患者随机对照试验结果的荟萃分析发现，在根除H.pylori治疗12个月后患者消化不良的改善明显高于对照组（比值比位1.38，95% CI: 1.18～1.62，需要治疗的患者数位17）^[5]。在南美洲巴西进行的一项大宗研究显示，H.pylori根除治疗12个月时消化不良症状评分下降至少50%的患者百分比为49%，明显高于对照组（36.5%）^[6]。国际上有关指南推荐对消化不良的患者行根除H.pylori治疗或采取“检测和治疗”（test and treat）策略。京都幽门螺杆菌全球共识（2014年）提出，对消化不良H.pylori阳性的患者，如果在成功根除H.pylori后6～12个月，消化不良症状得到长期缓解，其消化不良症状则归因于H.pylori胃炎。罗马Ⅳ委员会支持这一观点^[1]。

我国普通人群和消化不良患者中H.pylori感染率均很高，尚缺乏预测消化不良患者根除H.pylori治疗后消化不良症状可获得缓解的预测因子，从降低日后发生消化性溃疡、胃癌的风险看，推荐对初诊的消化不良患者及时进行胃镜检查排除器质性疾病，评估胃炎的严重程度，同时检测H.pylori；对有明显活动性胃炎、H.pylori阳性的患者推荐根除H.pylori治疗^[7,8]；对无明显活动性胃炎的消化不良、合并H.pylori感染的FD患者，经验性对症治疗无效时，要与患者讨论利弊后决定是否根除H.pylori治疗^[7]。对根除H.pylori后消化不良症状缓解者，将FD的诊断修正为H.pylori相关性消化不良，现阶段在我国的可操作性差，对患者而言此举价值有效。

3  充分结合中国的国情制定诊断流程

罗马Ⅳ提出了常见的胃肠道症状和部分FGIDs诊断流程^[1,9]。这些诊断流程让读者能清晰了解分步骤评估病情、有针对性选择辅助检查，以最简捷、明了的方式对患者的疾病作出处置。胃食管反流病（gastroesophageal relux disease，GERD）、功能性烧心（functional heartburn）、反流高敏感（reflux hypersensitivity）、嗜酸性粒细胞性食管炎等疾病均可表现为烧心，患者对质子泵抑制剂（proton pump inhibitor, PPI）治疗有效提示其可能为GERD或者反流高敏感；对PPI治疗无效、内镜下食管黏膜外观正常的患者，取食管黏膜活检行组织病理学检查可以排除嗜酸性粒细胞性食管炎，也有助于鉴别非糜烂性胃食管反流病（non-erosive relux disease, NERD）和功能性烧心。研究资料表明，NERD患者存在黏膜基底细胞增生、乳头样增生、细胞间隙增宽等改变^[10]，但对这些细微改变的观察需要病理科医生有较丰富的经验。罗马Ⅳ委员会建议对通过内镜和组织病理学检查不能诊断为GERD（主要是NERD）的患者，建议在停用PPI后行pH或pH阻抗监测，明确患者食管酸暴露是否正常，进一步分析烧心症状与反流事件的相关性对患者的烧心作出病因诊断^[1]（见图1）。

图1罗马Ⅳ提出的胃食管反流病和功能性烧心、反流高敏感的鉴别诊断流程图^[1]

Fig 1 Diagnostic algorithms recommended by Rome Ⅳ for distinguishing GERD from functional heartburn, reflux hypersensitivity in patients with heartburn^[1]

现阶段对NERD食管黏膜组织病理学改变的某些指标如细胞间隙增宽尚缺乏统一的标准，并非所有的医院中均配备有这种资质的医生；食管pH或pH-阻抗监测在我国尚未普及。另一方面，在NERD、功能性烧心和反流高敏感中均有部分患者存在精神心理方面的因素或合并焦虑抑郁，少部分患者烧心可能是躯体化症状的表现，忽略这一方面可能使一些患者接受不必要的pH或pH-阻抗监测。因此，在我国对烧心患者的鉴别诊断不宜完全照搬罗马Ⅳ的建议。结合我国的实际情况，笔者提出在以烧心为主要表现的患者中，可将PPI试验治疗作为轻-中度症状、无警报征象患者的首选；强调早期关注患者的心理状态，必要时行心理评估；在内镜下外观黏膜正常时应根据患者的情况决定是否取活检（怀疑嗜酸性粒细胞性食管炎）；优化抗反流治疗可作为部分内镜检查阴性患者的选择；对优化抗反流治疗无效的患者建议在使用PPI时（PPI-on）进行pH或pH阻抗监测（见图2）。流程图中还增加了相应的治疗指导建议。

图2 以烧心为主要表现的诊治流程图

Fig 2 Diagnostic and therapeutic algorithms for patients with heartburn

对FD、IBS等疾病的诊断还要充分考虑到需要鉴别诊断的疾病谱的特殊性和我国医疗资源的特殊性等因素。我国食管癌和胃癌发病率较高、结直肠癌中年轻患者所占比例较高、内镜检查较为普及且费用较低、炎症性肠病患病率逐年升高、乳糜泻相对少见。

精神心理因素在FGIDs的发病、发展和转归中起重要作用，但精神心理异常的表现并没有列入FGIDs的诊断标准。多数非心理专科医生对精神心理障碍的关注度还不够，我国患者往往不愿意接受心理归因的解释，使得部分患者为寻求器质性疾病的诊断接受过度的诊疗。我们需要进一步普及和提高相关科室临床工作者对FGIDs患者合并的心理问题的识别和处理能力。

4   客观评价FGIDs患者的胃肠功能

罗马IV功能性排便障碍的诊断标准强调必须有球囊逼出试验、肛门直肠压力测定或肛周体表肌电图、影像学检查中的至少2项检查证实患者有特征性的排出功能下降（指不协调性收缩、直肠推进力不足）^[1]。球囊逼出试验简单易行，只能作为排便障碍的初筛检查。并非所有的医院均能开展肛门直肠压力测定、肛周体表肌电图、排粪造影等检查，因此套用诊断标准无疑会使相当一部分患者不能诊断功能性排便障碍，或增加转诊检查的负担。实际上，对以排便障碍症状为主要表现的便秘患者（排便费力、排便时肛门直肠堵塞感、排便不尽感等），特别是轻、中度症状的患者，根据患者的主要症状采用经验性治疗，对经验性治疗无效、重症患者有针对性地选择辅助检查，了解患者肛门直肠的排便功能，必要时了解形态结构的改变，是符合我国国情的诊治模式。

同样，在功能性食管病的诊断中，必须“无主要的食管动力障碍性疾病”，包括贲门失弛缓症/胃食管连接部流出道梗阻、弥漫性食管痉挛、jackhammer食管、蠕动缺失，这意味着诊断功能性食管病患者必须接受高分辨食管压力测定，现阶段该项检查在我国尚不普及。如前文所述，对以烧心为主要表现的患者，食管动力障碍性疾病的可能性较小，高分辨食管压力测定对诊断和鉴别诊断的价值有限。

此外，对嗳气症、功能性消化不良、胆管和胰管Oddi括约肌功能障碍的患者在选择相应辅助检查时也要充分考虑到患者和我国的实际情况。

5  充分利用和体现我国的治疗资源和特色

•  Ⅳ指出，FGIDs尚缺乏特效的治疗方法，良好的医患关系是治疗的重要组成部分，对症治疗应基于可能的病理生理机制，根据严重程度指导治疗（即多维度临床资料剖析），强调精神心理干预在治疗中的重要性^[1]。我们必须注意到，罗马Ⅳ引用的常规治疗药物主要基于美国的药物资源（有关促动力药的信息较少），新药的临床试验资料主要是在西方人群进行的研究（如促分泌药），西方国家精神心理治疗的资源明显优于我国。治疗资源的差异、人群对一些药物反应（包括药效、代谢途径和不良反应）的差异、对新药的期待和期待效应是我们在应用罗马Ⅳ诊治建议时需要考量的问题。在FGIDs的治疗中，我们还有许多方面亟待完善，如避免PPI的过度使用、避免刺激性泻剂的滥用、抗焦虑抑郁药的规范使用等等。我国具有中医中药的独特优势，一些重要方剂和成药的疗效在长期的实践中得到证明，越来越多的随机对照研究证实其有效性。针灸治疗功能性便秘即是一个很好的例证^[11]。在FGIDs的治疗中，我们需要充分利用我们的资源优势，体现中国特色。
•  FGIDs患者而言，尤其是合并精神心理障碍者，解释、安慰和心理疏导，建立良好的医患关系至关重要，是治疗的重要组成部分。现阶段，没有一种药物、一种治疗方案能解决所有患者的问题，FGIDs患者更加需要高度个体化的综合治疗方案。

参考文献

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2. 论著模板

肠易激综合征模型大鼠结肠肌间神经丛钙视网膜蛋白阳性神经元增加

李  珊^1，2，杨希林¹，费贵军¹，刘晓红^１，　方秀才^１

•  中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院消化内科，北京 100730；2. 首都医科大学附属北京安贞医院消化内科

【摘要】  目的  检测肠易激综合征腹泻型（IBS-D）和便秘型（IBS-C）两种模型大鼠远端回肠、结肠黏膜下神经丛（SMP）和肌间神经丛（MP）钙视网膜蛋白（CALR）阳性神经元的变化，探讨其在IBS发病中的作用。方法  分别采用慢急性联合应激、冰水灌胃法建立IBS-D和IBS-C大鼠模型，制作回肠和结肠SMP、MP全层铺片标本，免疫组织荧光双染法检测CALR阳性神经元的改变。结果  与对照组相比，IBS-D和IBS-C模型大鼠回肠SMP、MP和结肠SMP中CALR阳性神经元比例的差异无统计学意义（P＞0.05），结肠MP中CALR阳性神经元的比例显著增加，分别为（17.2±3.2）% vs（13.4±2.9）%、（19.1±5.9）% vs（14.9±3.4）%，差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论  IBS-D、IBS-C模型大鼠结肠MP中CALR阳性神经元增加可能参与IBS肠道敏感性增高。

【关键词】  肠易激综合征；黏膜下神经丛；肌间神经丛；神经元；钙视网膜蛋白

中图分类号：R574.4      文献标识码：A      文章编号：      收稿日期：2018-02-10

Increase of calretinin-immunoreactive enteric neurons in rat models of irritable bowel syndrome with diarrhea and with constipation

LI Shan^{1, 2}, YANG Xilin¹, FEI Guijun¹, LIU Xiaohong¹, FANG Xiucai¹ 

1. Department of Gastroenterology, Peking Union Medical College Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 10073; 2. Department of Gastroenterology, Beijing Anzhen Hospital, Capital Medical University, China

【Abstract】  Objective  To investigate the changes of calretinin-immunoreactive (CALR-IR) enteric neurons of submucosal plexus (SMP) and myenteric plexus (MP) in distal ileum and colon in rat models of irritable bowel syndrome with predominant diarrhea (IBS-D) and with predominant constipation (IBS-C). Methods  Rat models of IBS-D were established with unpredictable mild stress and acute wrap restrain stress (CAS) and IBS-C were induced by administering cold water. Double immunohistochemical fluorescence staining with whole-mount preparations of SMP and MP was used to detect the changes in neurons with positive CALR-IR and their co-localization with the pan neuronal marker, anti-Hu. Results  There was no statistically difference in the proportions of CALR-IR neurons in ileal SMP and MP in IBS-D and IBS-C modeling rats comparing with corresponding controls. The similar results were found in colonic SMP in both IBS groups. While in colonic MP, the proportions of CALR-IR positive neurons in IBS-D modeling rats and IBS-C modeling rats were significantly increased comparing with corresponding control group [(17.2±3.2)% vs (13.4±2.9)%, (19.1±5.9)% vs (14.9±3.4)%, P<0.05)]. Conclusions  The increases of CALR-IR sensory neurons in MP of the IBS modeling rats may be involved in the visceral hypersensitivity of the IBS.

【Key words】  Irritable bowel syndrome; Submucosal plexus; Myenteric plexus; Neurons; Calretinin

肠易激综合征（irritable bowel syndrome，IBS）是临床常见的功能性肠病，以腹痛或腹部不适伴排便异常为特征，罗马IV将其分为腹泻型IBS（IBS with predominant diarrhea，IBS-D）、便秘型（IBS with predominant constipation，IBS-C）、混合型（IBS-M）等亚型。IBS的病因尚不清楚，肠神经系统（enteric nervous system，ENS）作为“胃肠道的大脑”（brain-in-the-gut）直接调控胃肠道的运动、分泌及与之相适应的血管舒缩活动等，其异常改变参与IBS的发病^[1-3]。钙视网膜蛋白（Calretinin，CALR）是一种钙结合蛋白，在ENS肌间神经丛（myenteric plexus，MP）和黏膜下神经丛（submucosal plexus，SMP）主要位于感觉神经元内，与IBS的关系尚不明确^[4]。本研究采用IBS-D和IBS-C模型大鼠远段回肠和远端结肠的肠神经丛全层铺片标本（whole mount preparations）观察SMP和MP中表达钙视网膜蛋白的神经元的变化，探讨其在IBS发病中的可能作用。

基金项目：十一五”国家科技支撑计划课题（2007BAI04B01）

第一作者简介：李珊，硕士，主治医师，研究方向：功能性胃肠病。E-mail: lishan_0407@163.com

通讯作者：方秀才，主任医师，教授，研究方向：功能性胃肠病、胃肠动力性疾病与肠神经系统。E-mail: fangxiucai2@aliyun.com

1  材料与方法

1.1  实验材料

1.1.1  实验动物：雄性Wister大鼠，体质量160~180 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，于北京协和医院SPF级动物房单笼饲养，室温20~24 ℃，12 h/12 h昼夜交替，自由进食进水。

1.1.2  主要试剂：实验中所使用的抗体及稀释比例如表1所示。

表 1  研究中使用的抗体

Tab 1  Antibodies used in the study

注：Anti-Hu：抗神经核抗体；CALR：钙视网膜蛋白；FITC：异硫氰酸荧光素；Cy3：吲哚菁染料；TRITC：四甲基异氰酸罗丹明。

1.2  方法

1.2.1  实验动物分组：大鼠按照体质量进行匹配，分成IBS-D组及其对照组、IBS-C组及其对照组，每组7只。

1.2.2  动物模型建立：（1）IBS-D组及其对照组：参照吕红等^[5]方法建立慢急性联合应激IBS-D大鼠模型，慢性应激期每日给予以下应激中一种：① 断水24 h；② 断食24 h；③ 夹尾1 min；④ 45 ℃加热5 min；⑤ 4 ℃冰水游泳3 min；⑥ 12 h/12 h昼夜颠倒；⑦ 水平震荡（160次/min）45 min。上述应激7 d为一周期，顺序随机，连续2 d内所给予应激种类不同，共持续21 d。慢性应激结束后第7日（即实验第28日）给予急性束缚应激1 h：将大鼠乙醚麻醉至昏迷，束缚双侧肩部、双前肢及胸部限制其上肢搔抓头面部，不限制其活动；对照组大鼠同期饲养，自由进食进水，不进行刺激。（2）IBS-C组及其对照组：采用冰水灌胃方法建立IBS-C模型^[6]，即每日予0~4 ℃生理盐水2 ml灌胃，共14 d。对照组大鼠同期饲养，自由进食进水，不进行灌胃。

1.2.3  解剖制备回肠和结肠的肠神经丛片标本：IBS-D及其对照组大鼠于第28日、IBS-C及其对照组大鼠于第15日进行以下实验。30~50 mg/kg戊巴比妥钠腹腔麻醉后剪断双侧颈部血管放血、处死大鼠，剖腹，取距回盲部20 cm处远段回肠6 cm、距肛门3~9 cm段远端结肠6 cm，沿肠系膜侧剪开肠管，于4 ℃含氧Kreb′s溶液冲洗干净，展开置于质量浓度为20 g/L的甲醛固定液固定24 h。将固定后的标本冲洗后显微镜下剥去黏膜层，然后将标本翻转依次解剖分离去除纵行肌和环形肌肌束，得到完整的SMP铺片标本。将标本浆膜面向上固定，在显微镜下将肠壁的纵行肌和环形肌一同从黏膜下层上剥离下来，然后将分离开的肌肉层环行肌面向上，将环形肌的肌束剥离，即可得到MP铺片标本。制作好的铺片标本浸于固定液中，室温保存备用。

1.2.4  Anti-Hu抗体免疫组织荧光检测方法：将制备好的SMP和MP铺片标本室温下PBS漂洗10 min×3次。二甲亚砜（DMSO）浸泡10 min×3次后PBS漂洗。0.1%硼氰化钠（NaBH₄）溶液浸泡10 min×3次后PBS漂洗。10% NDS（封闭血清）室温孵育2 h。加Anti-Hu一抗室温过夜。PBS再次漂洗后加入驴抗小鼠IgG二抗1 h，室温避光。PBS漂洗后将标本完全展开平铺于载玻片上，甘油封片后应用荧光显微镜（Nikon eclipse 80i）观察。

1.2.5  Anti-Hu抗体和CARL抗体免疫组织荧光双染法：按以上所述操作后，荧光显微镜观察到标本中神经元Anti-Hu抗体免疫反应呈阳性后，即进行CALR抗体染色。其步骤如下：PBS漂洗后加CALR抗体，4℃避光过夜。PBS漂洗后加山羊抗兔二抗1 h，室温避光。PBS漂洗，铺片、封片后观察并计数。

1.2.6  SMP神经元计数：每只大鼠取2张SMP铺片标本，每张标本随机选取5个不重合低倍视野（10×20倍），单盲法分别计数视野内神经节数目、神经元总数（anti-Hu免疫反应阳性）以及双染中CALR抗体免疫反应阳性神经元数目。每只大鼠取2张MP铺片标本，每张标本随机选取7~8个（共15个）不重合低倍视野（10×20倍），单盲法分别计数视野内神经元总数（Anti-Hu免疫反应阳性）以及双染中CALR抗体染色阳性神经元数目。以x±s表示。

1.3  统计学处理  采用SPSS 11.0统计软件进行数据处理。两组间数据比较采用两独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2  结果

本实验中所应用的慢急性联合应激大鼠模型和冰水灌胃模型可分别模拟IBS-D和IBS-C患者肠道运动、内脏敏感性和心理行为等方面异常^[5-6]。我们在此前发表的文章中有数据表明IBS-D大鼠有腹泻、内脏高敏感，IBS-C大鼠具有便秘、内脏高敏感的表现^[1，3，7]。

2.1  大鼠肠道CALR阳性神经元荧光染色特点  采用免疫组织荧光双染法分别检测IBS-D及其对照组、IBS-C及其对照组大鼠远段回肠、远端结肠SMP和MP中CALR阳性神经元，发现CALR阳性染色在SMP和MP神经元的胞浆、胞核、神经纤维均有表达，阳性神经元均为卵圆形，不同神经元胞体免疫反应（immunoreactive，IR）强度有一定差异（见图1）。 

图 1  IBS-D大鼠结肠肌间神经丛中Anti-Hu阳性和CALR阳性神经元的免疫荧光双染图  A1~3：IBS-D组对照大鼠；B1~3：IBS-D组大鼠。A1、B1为Anti-Hu阳性神经元；A2、B2为CALR阳性神经元；A3、B3为Anti-Hu/CALR双阳性神经元。标尺＝50 μm；Anti-Hu：抗神经核抗体；CALR：钙视网膜蛋白

Fig 1  Enteric nervous ganglia and neurons in whole mount preparations of colonic submucosal plexus (SMP) in IBS-D modeling rats  A1-3 were SMP of control group, B1-B3 were SMO of IBS-D rats. A1, B1: Anti-Hu-IR labeled all neurons in the SMP, A2, B2: CALR-IR neurons in the SMP, and A3, B3 Merged picture of Anti-Hu/CALR-IR. Scale bar=50 μm

2.2  IBS-D模型大鼠肠神经丛CALR阳性神经元的改变  与对照组相比，IBS-D大鼠回肠SMP、结肠SMP和回肠MP中CARL阳性的神经元数目及比例差异无统计学意义，结肠MP神经元中CALR阳性神经元数目差异无统计学意义，但结肠MP神经元中CALR阳性神经元所占比例较对照组高[（17.2±3.2）% vs （13.4±2.9）%]，差异有统计学意义（P=0.040）（见表2）。

表 2  IBS-D模型大鼠回肠、结肠SMP、MP中CALR阳性神经元数目及比例

Tab 2  Calretinin-immunoreactive neurons of ileal and colonic SMP and MP in IBS-D modeling rats

注：IBS-D：腹泻型肠易激综合征；SMP：黏膜下神经丛；MP：肌间神经丛；CALR：钙视网膜蛋白。与对照组比较，*P <0.05；每组n=7。

2.3  IBS-C模型大鼠肠神经丛CALR阳性神经元的改变  与对照组相比，IBS-C大鼠回肠SMP、结肠SMP和回肠MP中CARL阳性的神经元数目及比例差异无统计学意义，结肠MP神经元中CALR阳性神经元数目差异无统计学意义，但结肠MP神经元中CALR阳性神经元所占比例较对照组高[（19.1±5.9）% vs （14.9±3.4）%]，差异有统计学意义（P=0.018）（见表3）。IBS-D模型大鼠、IBS-C模型大鼠结肠MP中CALR阳性神经元所占比例均较对照组高（见图2）。

表 3  IBS-C模型大鼠回肠、结肠SMP和MP中CALR阳性神经元数目及比例

Tab 3  Calretinin-immunoreactive neurons of ileal and colonic SMP and MP in IBS-C modeling rats

注：IBS-C：便秘型肠易激综合征；SMP：黏膜下神经丛；MP：肌间神经丛；CALR：钙视网膜蛋白。与对照组比较，*P <0.05；每组n=7。

图 2 IBS-D及IBS-C模型大鼠结肠MP中CALR阳性神经元比例改变  与对照组相比，IBS-D和IBS-C大鼠结肠MP中CALR阳性神经元所占比例较对照组高，差异有统计学意义

Fig 2  Changes of CALR-IR neurons in MP of colon in IBS-D and IBS-C rats  CALR-IR neurons were increased in colon MP of IBS-D and IBS-C rats compared with the control groups

3  讨论

IBS的发病机制复杂，动物模型是对其进行研究的重要手段，稳定性高、可重复性好，评价指标客观的动物模型对认识疾病的机制、病理生理特点、药物治疗等有重要意义^[8]。本研究采用的慢急性联合应激大鼠模型能模拟IBS-D患者肠道运动、感觉和心理行为等方面异常^[1，3，5]，冰水灌胃大鼠模型能模拟IBS-C患者相关异常^[6-7]。

钙视网膜蛋白是钙结合蛋白（calcium-binding protein）家族成员，最早从鸡的视网膜基因谱中克隆而得名。该蛋白相对分子量为30~31 kDa，是由16q22-q23基因编码含有269~273个氨基酸，其组成在许多物种间高度保守^[9]。CALR包含6个“EF-hand”样结构域，其中5个为功能性的Ca²⁺结合位点；在中枢和外周神经系统均有广泛表达，同时也在肾上腺、胰岛、睾丸等组织有表达，参与机体生殖和内分泌功能调节^[9]。CALR主要功能是作为快速或慢速Ca²⁺缓冲剂，维持细胞中Ca²⁺稳态，对兴奋性神经毒性起保护作用^[9]；还可作为感受器（sensor）监测细胞中Ca²⁺浓度，并与钙通道蛋白Ca_V2.1结合以双向调节突触连接的可塑性，从而影响神经元的兴奋性^[8]。

CALR在肠神经系统的SMP和MP中均有广泛表达。虽然存在一定的种属差异，但与研究最广泛的豚鼠相比，大鼠ENS中CALR的分布与人类更为接近^[10]。既往研究发现，大鼠回肠MP中40%~50%的神经元为CALR阳性，且95%以上同时为胆碱乙酰转移酶（choline acetyltransferase，ChAT）阳性，其中表达NK₁受体+/NK₃受体+/CALR+/Calbindin+的神经元为Dogiel Ⅱ型内在感觉神经元。近年研究发现，除了上述感觉神经元之外，CALR阳性神经元中约18%同时表达Ca²⁺/钙调蛋白依赖的蛋白激酶II（CMKII），这些神经元为Dogiel I型中间神经元^[11]。在大鼠SMP，CALR+/SP+阳性神经元亦主要为感觉神经元，参与肠道的分泌运动反射^[12]。在人的SMP大多数神经元同时表达CALR+/VIP+/ChAT±，形态上具有多树突的结构并主要支配黏膜层，在结肠约占SMP神经元总数75%，小肠比例略低于结肠^[13]。在人的MP中，约10%神经元同时表达CALR与生长抑素，这可以作为Dogiel Ⅱ型内在感觉神经元的标记^[14]；也有部分Dogiel I型中间神经元也为CALR阳性。目前，尚无针对IBS患者神经丛中CALR神经元方面的研究。

本研究发现，在IBS-D和IBS-C模型大鼠中，CALR阳性神经元的比例在回肠SMP、MP和结肠SMP中与对照组相比，差异均无明显统计学意义，而结肠MP中明显升高。这提示结肠MP中CALR阳性神经元的增多可能参与IBS-D和IBS-C共同发病机制（即内脏高敏感），但与IBS亚型无关。在大鼠MP中，CALR阳性的感觉神经元可发出轴突至黏膜层，对腔内化学物质改变等刺激产生反应，其增加可能参与IBS肠道敏感性增高，而与结肠动力无关；部分同时表达CMKII的神经元在调节肠道运动中有重要作用^[11]，从而影响IBS的动力功能。

一直以来IBS被认为是功能性疾病而缺乏解剖学和生化异常，但近年研究发现与健康人群相比，IBS患者存在一定程度的形态学改变，如炎症细胞浸润、肠道通透性增高以及神经内分泌改变^[15]。我们既往研究也发现，在IBS-D模型大鼠肠道中SMP的血管活性肠肽（vasoactive intestinal peptide，VIP）阳性神经元比例增高，MP中一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）阳性神经有比例降低，它们可能分别通过影响肠道的分泌和动力参与其腹泻症状的产生^[1，3]。由于难以获得IBS患者全层活检（full-thickness）标本，目前仍不清楚IBS患者ENS是否存在类似异常。但部分IBS患者血清中检测出多种抗肠神经元的自身抗体^[2，16]，且抗肠神经元阳性的IBS患者血清在体外可引起豚鼠肌间神经元和传代培养的人神经母细胞瘤细胞SH-Sy5Y的凋亡，推测自身免疫反应可能参与ENS改变引起的肠道功能异常^[17]。近年国外有报道一种新的内镜下全层活检技术（FTRD System，德国）使肠道全层活检取材成为可能，用于研究IBS患者ENS神经病变，以指导并选择针对性治疗方案，但与腹腔镜下活检的传统方法相比，其安全性和有效性仍需进一步评估^[18-19]。

本研究存在一定缺点，由于检测肠道传输功能使用的是活性炭标记技术^[1，5]，未能在同一只大鼠同时检测肠道动力和内脏敏感性变化，无法将ENS改变与动力异常进行相关性分析。

综上所述，本研究发现IBS-D和IBS-C大鼠均有结肠MP中CALR阳性神经元比例增高，推测其可能在IBS的内脏高敏感机制中起一定作用，需要将来进一步深入研究加以证实。

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